碧云天生產(chǎn)的Seamless Cloning Kit(無縫克隆試劑盒)是一種新型的基于插入片段和線性化載體的末端進(jìn)行同源重組的基因克隆試劑盒。本試劑盒利用包含了DNA 5' 外切酶(5' Exonuclease)、DNA聚合酶(DNA Polymerase)和DNA連接酶(DNA
Ligase)活性的重組酶(assembly enzyme)，通過同源重組的方法可以將一個或多個DNA片段按照預(yù)定方向、快速、高效和精確
地插入到線性化載體中，并且最終構(gòu)建的克隆沒有任何額外的堿基序列，因此被稱作“無縫克隆”。
和傳統(tǒng)的基因克隆方法相比，本試劑盒的無縫克隆方法有多方面的突出優(yōu)點：(1) 最終構(gòu)建的克隆沒有任何額外的堿基序列，因此是真正的"無縫克隆"；(2) 可通過一個反應(yīng)將一個或多個片段快速、定向地插入到載體的任何位置；(3) 待插入的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物無須酶切；(4) 插入片段的大小范圍寬，從20bp左右的小片段到10kb左右的大片段都可以成功插入；(5) 可通過PCR擴(kuò)增獲得線性化載體，因此限制性內(nèi)切酶消化并不是克隆所必須的；(6) 酶催化的重組連接反應(yīng)非?？焖俸透咝?，對于一個片段的插入僅需50℃處理15分鐘；對于三個片段的插入僅需50℃處理30分鐘，而對于5個片段的插入也僅需50℃處理約60分鐘；(7) 只有插入片段和線性化載體的末端才能發(fā)生同源重組，可以有效避免非特異性的同源重組；(8) 陽性克隆比例高，單個DNA片段克隆的陽性率幾乎為100%，三個片段的克隆陽性率約為70-80%。
本無縫克隆試劑盒操作非常簡單。本試劑盒進(jìn)行基因克隆時沒有酶切位點的限制，僅需在載體的預(yù)定克隆位點通過酶切進(jìn)行線性化或通過PCR的方法直接制備線性化的載體，在插入片段的兩個PCR引物的5' 端引入與載體克隆位點兩端完全一致的
15~25bp的重疊序列。重組反應(yīng)可以在50℃快速進(jìn)行，3-4小時內(nèi)即可完成從DNA樣品的PCR擴(kuò)增、純化、重組、到轉(zhuǎn)化涂板的全部操作。其中PCR反應(yīng)約2-3小時，PCR產(chǎn)物純化約20分鐘，重組反應(yīng)15分鐘，轉(zhuǎn)化涂板約40分鐘，共計約3-4小時即可完成。